Σε πειράματα PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), η συσκευασία μπορεί να φαίνεται απλή, αλλά επηρεάζει άμεσα τη σταθερότητα του αντιδραστηρίου, την ευκολία χρήσης και τα αξιόπιστα αποτελέσματα. Είτε η αποθήκευση και η μεταφορά LAB - παρασκευασμένα αντιδραστήρια ή εμπορικά πριμοδότες, η κυριαρχία των κατάλληλων τεχνικών συσκευασίας PCR μπορεί να αποφύγει τα κοινά σφάλματα και να βελτιώσει την πειραματική αποτελεσματικότητα. Παρακάτω, μοιραζόμαστε πρακτικές συμβουλές σχετικά με την επιλογή υλικών, τις στρατηγικές συσκευασίας και τις λεπτομέρειες αποθήκευσης.
I. Επιλογή υλικού συσκευασίας: Προτεραιότητα στη συμβατότητα και την προστατευτικότητα
Οι αντιδράσεις PCR είναι ευαίσθητες στη θερμοκρασία, το φως και τους μολυντές, έτσι τα υλικά συσκευασίας πρέπει να πληρούν τρεις βασικές απαιτήσεις: αεροστεγές, φως - proofing και χημική αδράνεια.
Για τους σωλήνες φυγοκεντρότητας και τις πλάκες PCR, προτιμάται το πολυπροπυλένιο (PP), λόγω της υψηλής διαφάνειας της και της DNase/RNase - ελεύθερων ιδιοτήτων . 0.2 ml λεπτούς - σωλήνες PCR είναι ιδανικές για γρήγορη μεταφορά θερμότητας, ενώ οι σωλήνες 0,5 ml είναι καλύτερα για την αποθήκη. Για 96 - καλά PCR πλάκες, σας συνιστούμε να επιλέξετε ένα περιστρεφόμενο σχέδιο (για ευκολία ρομποτικής χειραγώγησης) ή ένα μη φούστα σχεδιασμό (για διατήρηση χώρου).
Μέθοδος σφράγισης: Οι συμβατικοί σωλήνες φυγοκέντρησης χρησιμοποιούν επίπεδη ή ανυψωμένα καπάκια (για να αποφευχθεί η εξάτμιση και η ξήρανση). Ωστόσο, για μεγάλο χρονικό διάστημα - αποθήκευση όρων, θερμαντικά - ταινία σφράγισης (όπως parafilm) ή αναπνεύσιμη μεμβράνη (όπως η Aeraseal) συνιστάται για την εξισορρόπηση της εσωτερικής και εξωτερικής πίεσης. Οι πλάκες PCR συνιστώνται τη χρήση κολλυστικών αλουμινίου αλουμινίου (υψηλή - ανθεκτική στη θερμοκρασία) ή Self - συγκολλητική μεμβράνη (για ένα - χρήση).
Προστασία φωτός: Τα αντιδραστήρια που περιέχουν φως - ευαίσθητα συστατικά (όπως ορισμένες βαφές ή εκκινητές) θα πρέπει να τυλιχτούν σε φύλλο αλουμινίου ή να χρησιμοποιούνται μαύρες πλάκες PCR (διαθέσιμες από ορισμένους κατασκευαστές).
Ii. Τεχνικές υποπτευμάτων: Ελαχιστοποίηση των απωλειών από επαναλαμβανόμενο πάγωμα - Κύκλοι απόψυξης
Τα αντιδραστήρια με επίκεντρο είναι ένα βασικό βήμα στη συσκευασία PCR και επηρεάζει άμεσα την πειραματική αναπαραγωγιμότητα.
Το Master Mix oriquoting: τα εμπορικά μίγματα (όπως το Enzyme Taq και το μίγμα DNTP) συνιστώνται για να περιοριστούν με βάση τον όγκο της αντίδρασης συν 5% - 10% περιθώριο (π.χ. για αντίδραση 20 μL, δείγμα 22 μΐ ανά σωλήνα). Αποφύγετε τη χρήση απευθείας από τη χύδην συσκευασίας, καθώς επαναλαμβανόμενη κατάψυξη - Οι κύκλοι απόψυξης μπορούν να οδηγήσουν σε μειωμένη δραστικότητα ενζύμου (το ένζυμο TAQ μπορεί να χάσει περίπου 5% δραστηριότητα ανά κύκλο κατάψυξης-απόψυξης).
Οι εκκινητές και τα πρότυπα: οι εκκινητές (ειδικά οι προσαρμοσμένοι εκκινητές) συνιστώνται για να κλέβονται από 100 μm αποθεμάτων και να αποθηκεύονται σε - 20 βαθμοί. Αραιώστε σε συγκέντρωση εργασίας (συνήθως 0,1-1 μΜ) πριν από τη χρήση. Τα πρότυπα όπως το γονιδιωματικό ϋΝΑ θα πρέπει να είναι υποπτευόμενες σε μονές - χρησιμοποιούν ποσότητες για να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση.
Συμβουλές πρόληψης μόλυνσης: Βεβαιωθείτε ότι οι σωλήνες φυγοκέντρησης είναι ξηροί πριν από την υποπτεία (υπολειμματική αιθανόλη μπορεί να αναστέλλει την PCR), πριν από το τοίχωμα και να φορούν γάντια σε όλη τη διαδικασία για να αποφευχθεί η μόλυνση του δερματικού DNA.
Iii. Επισήμανση και τήρηση αρχείων: Αποφύγετε την παγίδα "Black Box"
Η καθαρή επισήμανση είναι ζωτικής σημασίας για τη συσκευασία PCR. Η εσφαλμένη επισήμανση μπορεί να καταστρέψει ολόκληρο το πείραμα.
Πληροφορίες για την υποχρεωτική επισήμανση: Όνομα αντιδραστηρίου (π.χ., "2 × TAQ mastermix"), συγκέντρωση/περιεχόμενο (π.χ. "10 mm dntps"), αριθμός παρτίδας (για ανιχνευσιμότητα), συνθήκες αποθήκευσης (π.χ.
Ειδική επισήμανση: Εάν το αντιδραστήριο περιέχει γλυκερόλη (αντιψυκτική), βαφές (π.χ. πράσινο SYBR) ή πρόσθετα (π.χ. BSA), πρέπει να παρέχονται πρόσθετες πληροφορίες (π.χ., περιέχει 50% γλυκερόλη, δεν αποθηκεύονται σε υψηλές θερμοκρασίες ").
Συγχρονισμός εγγραφής: Συνιστάται να χρησιμοποιείτε λογισμικό υπολογιστικού φύλλου ή εργαστηριακής διαχείρισης (π.χ. LabGuru) για την καταγραφή των λεπτομερειών παραμέτρων των περιεχομένων κάθε σωλήνα (π.χ. ακολουθία εκκινητή, τιμή TM) και να τα συσχετίσετε με τον αριθμό φυσικής ετικέτας.
Iv. Αποθήκευση και μεταφορά: Εξισορρόπηση της θερμοκρασίας και της φυσικής προστασίας
Η σταθερότητα των αντιδραστηρίων PCR εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες αποθήκευσης και απαιτείται πρόσθετη προστασία κατά τη μεταφορά.
Γενική αποθήκευση:
Ένζυμα (TAQ, αντίστροφη μεταγραφάση): μακρά - αποθήκευση όρων σε - 20 βαθμοί (αποφύγετε τους επαναλαμβανόμενους κύκλους ψύξης -απόψυξης · υποπολλαπλάσιο και αποθηκεύστε σε -80 βαθμούς για μελλοντική χρήση).
Εκκινητές/ανιχνευτές: αποθηκεύστε σε -20 βαθμό για πάνω από 1 έτος (εάν περιέχει μια τροποποιημένη ομάδα όπως η βιοτίνη, προστατεύει από το φως).
Μη - buffers ενζύμων (π.χ. PBS): βραχυπρόθεσμα - αποθήκευση όρων σε 4 βαθμούς (έως 1 μήνα).
Απαιτήσεις μεταφοράς:
Για τη μεταφορά ψυχρής αλυσίδας, χρησιμοποιήστε ξηρό πάγο (- 78 βαθμού) για ένζυμα (που διατηρούνται παρακάτω -20 βαθμοί) και μπλε πάγο (περίπου 0 βαθμοί) για buffers για βραχυπρόθεσμες μεταφορές.
Αποφύγετε την υπερβολική δόνηση (οι πλάκες PCR πρέπει να ασφαλίζονται σε αφρώδη κουτιά για να αποφευχθεί η ανάμειξη αντιδραστηρίων μεταξύ πηγαδιών).
Κατά τη διάρκεια των υψηλών καλοκαιρινών θερμοκρασιών, προσθέστε ένα μονωτικό στρώμα στη συσκευασία (π.χ., τσάντα μόνωσης αλουμινίου αλουμινίου + πακέτο παγωμένης γέλης).
V. Κοινά προβλήματα και λύσεις
Πρόβλημα 1: Κατοικίες αντιδραστηρίου (π.χ. βροχόπτωση ή MGCL₂ σε χαμηλές θερμοκρασίες) → Λύση: Εν συντομία φυγοκεντρητής (1000 σ.α.λ., 1 λεπτό) πριν από την κοίταξη. Διαλύστε σε εκκολαπτήριο 37 μοιρών πριν από τη χρήση και το Vortex για να αναμειχθεί προσεκτικά.
Πρόβλημα 2: Το σφραγιστικό πλάκας εύκολα ξεφλουδίζει → Λύση: Επιλέξτε θερμότητα - ανθεκτικό σφραγιστικό με συγκολλητική υποστήριξη ή χρησιμοποιήστε ένα σφραγιστικό θερμότητας (κατάλληλο για υψηλή - πειράματα διακίνησης).
Πρόβλημα 3: Ετικέτες θολών → Λύση: Χρησιμοποιήστε έναν αδιάβροχο δείκτη (όπως ένα sharpie) ή λέιζερ - ετικέτες εκτύπωσης για να αποτρέψετε τη διαγραφή του χειρόγραφου από το αλκοόλ.
Σύναψη
Η συσκευασία PCR είναι κάτι περισσότερο από απλά αντιδραστήρια "συσκευασίας". Είναι η πρώτη γραμμή άμυνας για πειραματική αξιοπιστία. Επιλέγοντας τα κατάλληλα υλικά, τυποποιώντας τη διαδικασία υποπτευμάτων, διατήρηση της διεξοδικής επισήμανσης και διατήρησης αυστηρού ελέγχου θερμοκρασίας κατά τη μεταφορά, μπορείτε να μειώσετε σημαντικά το ανθρώπινο σφάλμα, εξασφαλίζοντας πιο σταθερές επακόλουθες αντιδράσεις ενίσχυσης και πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. Θυμηθείτε: Λεπτομέρειες Καθορίστε την επιτυχία. Οι κατάλληλες πρακτικές συσκευασίας PCR μπορούν να εξοικονομήσουν σημαντική αντιμετώπιση προβλημάτων χρόνου σε όλο το πείραμα σας!